获取一个基因CDS序列(🎬)的方法(👅)如(🤨)下：
打(😙)开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如(🎱)下图，按照顺序，在(🚋)1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处(📣)的Search，等出来结果之(🌻)后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一(🐁)步筛(🏸)选(🎗)（如果(🎩)你(🚣)要做鼠源的就选Mus musculus，其他(⛹)种属选择相应(🗻)的名称即可(🔷)进一步筛(⛩)选了）
然后第一条就是(📵)我(💟)们需要的序列信息，点击(✌)进(🗄)去，往(🔏)下拉(〽)，直到看到(🌰)CDS（(🏅)如下图）
点击CDS，就出现了下(👶)图中所(💝)示内容，其中(🥤)加了(🥞)底(🦉)色的部分序列便(🌏)是我们需要的序列了，可以看(🕉)到这段序列(🌹)开头(📒)是ATG起始密码(🖤)子，最后(😳)三位是TGA终止密(📫)码子。选中这段序列复制(🏫)即可。
由于需要PCR整个CDS区(🌳)域，所以正反向引物并没有(🧑)多(🐩)少选择(🀄)的余(🌜)地(⛲)，甚至可以参照上述(🌭)原则简单粗暴(🥑)的从正反向各(🏚)选(🌟)择22个(🍭)碱基左右作为引(📥)物，例如：!
正向(🌿)引(🛬)物序列与CDS相同，反向引物(🚁)序列与(🍣)CDS互补。另外要注意的是写(🏗)引物等序(🤰)列都(🗼)是要5’到3’的方向，一般不会从3’(🌺)到5’，所以(❗)我们的CDS虽(🏸)然没(🎆)有注(♟)明方向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以这(🥂)么(🎇)简单粗暴的设计引物(🐪)，但是还是想借此(🐵)教大家使用一下(🗳)引物设计的经典(⚓)软件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如(🆑)下图，首先点击File->New->DNA Sequence，
然(🏙)后(🥧)点击空白处(🌥)Ctrl V粘贴我(🚌)们的CDS序列(🏆)，选择As is，即我们(✨)复制(🔂)的(👾)是什么样的序列就粘贴(🍋)的什么样的序列。
下面的依次(🐙)是“反向序列粘(🚀)贴”、(📮)“互补序列粘贴”“反向互补序列粘(🤠)贴”。
点击左上角的Primer，如下(⛺)图，S=Sense，A=Antisense
如果对现在的引物不(🍱)满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们(📦)删除掉末尾(🚕)三个碱基，之后需(🤠)要先点击Analyse，然(🌖)后才能点击OK，我们可以(🤲)看到正向(🧕)引物已经从25个碱基变为22个碱基(📋)了。
最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘(🦃)贴也会自动变为5’到3’(🗺)的序(🌁)列(🈯)。所以非常方便。
这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物(🏘)就(🍈)初(🤸)步设计好了。如果你只是想(🌦)P出PDCD1这个基因(🌮)，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载(🔭)体上，那么我(🥤)们还要对(🔯)其进行进一步(📍)的加工(㊗)。
Primer 5的使用
根(🧠)据不(➡)同的目的，可以选(🙇)择不同的载体，如过表(🚈)达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化(📄)（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲(🎗)除(🍝)（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
从质粒图谱上可以看(❔)到多克隆(🛰)位点有(🛬)多(🚆)个酶切位点(⏫)可以(💖)选择，那是(♉)不是每个位(🙍)点都可以用呢(🐂)？(🕳)当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的(🏀)基因）本身没(🥫)有的酶切位(💟)点！
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点(👂)击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选(📐)择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后(🤘)点(🖋)击OK，可以看到PDCD1中有(🐽)ApaI和KpnI两个酶(🎪)切位点，所以这两个不(🌎)可(🥛)以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的(🤤)那些(⛱)酶了。比(🃏)如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在(🗂)对引物加上相应的酶切位(📍)点了。
于是我们得到(♓)如下引物：
好了，我们现在(🗒)就可以将这些引物送去相应公司合成了。
质粒构建
终(📿)于到正题了！
待引物合成之后，我们(🍬)用ddH2O将其稀释(🌸)到 100 μM 作为(🚴)母液，取一些稀释到 10 μM 做下一(🌏)步实(〽)验了。
首先(🥇)我们P出目的基因，这一(💏)步建(🍵)议(💉)用高(🐊)保真PCR酶，我常用(🚮)的是(👭) Toyobo公(🚙)司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及(🔶)反应条(📧)件如下(😋)图：
模板的获取
PCR完(🔽)成(🤓)之(🚶)后跑1%的胶回收目的片段(🔩)，也可(👁)以直接用PCR Clean试(🐻)剂盒回收。回收之后将其双酶(🥡)切，同时(🚆)需(💷)要酶(👏)切适量载体。如(🦁)果(🕠)你使(🎧)用的是Fermentas (Thermo)的(🏷)酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所(🗃)用的(💪)最(😴)佳Buffer。
酶切(🔐)回收之后的(😐)片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：(👺)
现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以(😈)连接完(👠)成，不过我保险(👖)起见(🔃)，一般(👧)连接30 min， 切勿连(🐾)接过夜！
连接完成(🆓)之后便是转化，挑菌（(☔)单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法(💔)抽提，Invitrogen的(📿)TRIzol是比较稳定且广泛(🗝)应用的(🦂)，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足(💘)大部分情况下(🙋)的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事项及原(⬜)理
注意事项：
1、RNA酶（(👩)RNase）非常(🛎)稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极(🚆)端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后(🚞)又会迅速复性。用常规的高温(🚫)高(🙉)压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完(💨)全失活。它广泛(⛲)存在于人的皮肤上，因(🉐)此(😟)，在与RNA制备(⛷)有(🌵)关的分子生物学实验时(💓)，必须戴(🚐)手套(🥏)。RNase的又一污染(🐒)源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取(✊)液(⏲)器的内部和外部(💙)。提取RNA时使用专门的(🐸)RNase-free的枪(🚼)头和(🍥)离心(📖)管。
2、TRIzol试剂具有(❤)较强(🏘)毒性，如沾到皮肤立刻用大量(🙀)的清洁剂和水冲洗！
溶液配方及(👗)原理：(🚻)
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细(🥘)胞内含物的同(🔦)时保持RNA的完整。其(📈)主(📂)要(🎇)成分是(🎴)苯(🤲)酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作(🥜)用是(🐩)裂解细胞，使细胞中(🧣)的蛋白、核酸物质解(🏍)聚得到(🔗)释放。异硫氰(🍸)酸胍(🎙)，是一(🌷)种(🥠)强力的蛋白质变性(⌛)剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消(🔌)失，导致细胞(💹)结构降解，核蛋白(🔑)迅速与(🐵)核酸分离(🅰)。
2、(🚖)氯(😳)仿：氯(🥖)仿(🤞)可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的(📗)抑制作用。另外氯仿作为有机(🈸)溶剂，加入(🐋)氯仿后离心(📰)可使溶液(🏌)分(👷)层，上层为水相(🕐)，下层为(🍹)有机相(🥪)。苯酚(⏩)为弱(🌶)酸性，酸性条(🌜)件下（一般为Ph5.0）DNA和(🛃)蛋白质进入有机相，而RNA留在(📈)水相；反之亦然(🥦)，弱碱性（(🔜)Ph8.0）时DNA留在水相(🍶)。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意(🔜)比例(🚪)互溶，因此加入异丙醇能够夺(🍭)取(🎣)RNA周(🐣)围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水(🚩)：DEPC是RNase的化学修饰剂(✈)，它与RNase的活性基团组氨(🕔)酸的咪(🥢)唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作(👟)时应小心。谁说(🐍)是最优秀的(😢)；谁是最(📶)自由的，谁也就(🖋)是(🌠)最优(🔣)秀(🥘)的，在他们(🎾)身上，才会有(🥡)最大的美。
操作步骤(🌄)
1、细胞破碎
A、组织(💑)：按(🕡)1 mL/50~100 mg组织样品(🍌)的比例向打散的组织(💽)块(🚪)中(✊)加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过(💃)TRIzol体(📵)积(💻)的10%。
B、(🗃)贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入(🌈)TRIzol试剂，并用移液枪反(🚚)复吹吸数次。TRIzol试剂(🏪)过(🛩)少会导致DNA污染。
C、悬浮细(🎳)胞：悬浮(🕍)细胞离心收集后，直(🃏)接按1 mL/5~10×(💕)106个细胞(⏲)（动物、(📨)植物或(✅)酵(🔋)母）的比例加入TRIzol试剂(🈷)。加入TRIzol前不要洗细胞，否则(📋)易造成mRNA的(✝)降解。
如(🚴)果(🎼)样品中含有较多的蛋白、(🤤)脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离(🏟)心(🎨)10 min去除(🎈)这些物质。
关于TRIzol的用(🎢)量，Invitrogen官方说明书(🥑)中有建议用量：
一般情况下，根据细胞量的多少我的用(🌡)量是：2~3 mL/10 cm Dish、(🚶)500μL~1 mL/6 cm Dish、(⚽)200~500 μ(😣)L/3.5 cm Dish（仅供(⏫)参(🌐)考）
2、氯仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃(🍉)~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体(🥍)充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖(🔋)紧管盖(🤗)后剧烈摇(🕶)晃15s，室温静(📬)置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过(🤒)高否则会导致RNA断裂。离心后液体分(😛)为(💹)三层，下层为(🕑)红色的有机相（酚-氯仿），中间(🐻)为白(👞)色的沉(✒)淀，上(🙍)层为无色的水(🏬)相(😪)。RNA在上层水相中，水相的体(🍱)积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀(🎿)
将上层水相转移(😒)到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质(🐪)就保存下层有(😟)机相。
加入与(🚕)水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附(♊)着在远离离心机轴心(🍰)的管底(🌐)，为无色(🥃)胶状。
4、(🍣)用乙醇洗涤去除残留的(🍘)蛋白质和无机盐
去除上清(⏮)后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的(〽)水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、(😹)用DEPC水(🔠)溶解RNA
去除上清后(📵)，将(🙂)管子敞口(🕛)晾5~10 min，使RNA沉淀(⛓)呈现半透明状。不要(🛋)让RNA沉(🏰)淀变成完(🤞)全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶(📙)解。根据后(⛰)续实验要求加入适量(🍌)的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。
逆(🈴)转(🖨)录法合成cDNA
一般逆转录(🧘)（也可称作反转录）(🙍)都(🥖)有现(🏣)成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作(🗿)，问题都不大，在这里我就以(➖)TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加(🚅)说(😋)明(😀)。
Random 6 mers 为随机(🐕)的6核(🔩)苷酸引(🕹)物，引(🗜)物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点(😲)是产物量大，特异性差，适(🛸)用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包(🛑)括rRNA、mRNA、tRNA等在内(🚘)的所有RNA的反转录反应都可使用本引物(🚭)。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（(🔖)A）(🔱)Tail的RNA，因(🖤)而(⏯)特异性好(🕖)，但因其只结合Poly A尾巴，对(🙀)于较(🏊)长的(🕳)mRNA，经常不能延伸到5'端(🌕)。（(😋)原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以(⛅)及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（(🐦)A）Tail）。
两种引物可据(👦)实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增(🔀)一种(♿)目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）(🔩)作(🍲)为反(😖)转录(📋)引物。
操作步骤
步骤简(🌐)述如下：按照下图(🖍)中(👃)1配制(🔰)溶(💆)液，然后65℃(🔲)处理后加入3中所配制(👖)溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常用的感受(🍽)态(💩)细胞有DH5α(🙉)、BL21（DE3）、Rossetta等，而(🚭)抽提质粒一般用DH5α，可以自己(🧕)制(🥕)备(🔟)也可以购买商业化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融，刚刚(🐨)融(😯)化(🆓)的感受态转化效率最高；
2. 避免反复(✍)冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸(🕤)；(🙌)
4. 感(⛸)受态和连(✉)接产物（或质粒）(😙)用量要适(🎵)中，并不(🥏)是越多越好。
操作步骤
1. 取50 μ(🥔)L感受(😉)态(⏳)细胞置于冰(⌛)上融化；(🦊)
2. 加入5 μL连(🧐)接产物(🐺)（质粒一(🙏)般只(🤩)需用白色枪头沾取(🍛)一下即可），混匀，置(💪)于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴(🆔)中热激90 s，迅速置于(🕝)冰(🐄)上静置(💃)2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养基（(🍮)不含抗生素(✖)），混匀后置(🙂)于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使(🍣)细胞复苏(💖)；
5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清(⏲)，留(🦂)取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部(🍡)均匀涂布(🧡)于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养(🚲) 16 18h；质粒：(🙎)直接取20 50 μ(🔬)L涂(🕠)于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提取
ABOUT 质粒抽提
实验原(🚫)理：
较(🛌)常用的质粒提取方法有三(⏫)种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两(🙇)种方法比较剧(🗯)烈，适用于(😧)较(👜)小(🍗)的质粒（<15kb）(🤪)。去污(🚗)剂裂解法则比较温和，一般用于(💨)分离大质粒（>15kb）。
碱裂解法是一(🐪)种应用最为广泛的制备质粒的方法(🌎)，其原理为：当细菌暴露于高pH值(💢)的(🍙)强阴离(🐜)子(🚖)洗涤剂中，会使细胞壁破裂(☝)，染色(🍀)体DNA和(✒)蛋白质变性，将(⚪)质粒DNA释放到上清中。
由于质(🙋)粒DNA分子比染色体DNA大(🔨)得多，且前者为共(🚔)价(💱)闭合(🕝)环(😉)状分(🐖)子，后者为线(🦕)状分子。只(🔩)要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值(🎉)恢(🤲)复(🍬)到中性时，质粒DNA双链就会再次形成(🙄)。
在裂解过程中，细菌(⛔)蛋白质、破(📈)裂的细胞壁和变(🉑)性的染色体(🖊)DNA会互相(👂)缠绕成大型复合物，后者被十二烷基(🖱)硫(🖌)酸盐（SDS）包盖。
当(⚪)用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有(🚾)效地沉淀下(🐤)来。离心(📝)除去沉淀之(🚭)后，就可以从上(👨)清中回收(👅)复性的质粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂(🐔)盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能(🚓)够结合到硅基质上，再(🚗)通过去蛋白液和漂洗液将(🔅)杂质和其它(👜)细菌成分(🖇)去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于(📙)酶切、PCR、测序(🍰)、细菌转化、转染等分(🍻)子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配方(🗓)不清楚，以下配方见《分子(🛎)克隆(🏪)实验指南》）(💕)
1、溶液(💪)P1：(🤸)50 mM葡萄(🚔)糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：(😗)Tris-Cl用于提供(🏛)一个合适的缓(🚿)冲(🥩)体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌(🏐)不会(🛵)快速沉积到管(😳)子的底部；而EDTA 作为Ca2 和(💍)Mg2 等二价金(🤧)属离子的螯(🌦)合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除(🕓)质粒中(🥚)混有的RNA，其(⬜)不受EDTA的影响。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的(🍁)作用在于(👦)使(🎼)细菌裂解，而SDS作用在(🌬)于(🏌)加(📮)入P3之后是被其包盖(🔦)的细菌蛋白，染(✂)色体DNA一起作为沉淀析(🤯)出。
3、(🍖)溶液P3：3 M 醋酸钾(😐)，2 M 醋酸(🌦)
原理：这一步的K 置换了(🤨)SDS（十(🐍)二烷基磺酸钠）(🥨)中(🎡)的Na ，得到(👖)PDS（十(🍝)二烷基磺酸钾(🚨)）(❗)沉(🐫)淀；SDS易与蛋白(🦐)质结合，平均两个氨基酸(💯)上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产(🕷)生的大量沉淀自然就将绝(📸)大部分蛋(🛴)白质也沉淀了，同时(🤙)染色体(👶)DNA也被(🍫)PDS共沉淀。而醋酸用(🗳)于中和(📮)碱(💅)，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作步骤
1、将(💈)过(🕐)夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子(🦈)，9000 rpm离心10 min，用泵尽量(🗽)吸除上清。若暂时不提取(💁)，可将沉淀保(🍱)存于(🔲)-20℃(🌔)，也可直接将菌液保(📓)存于4℃（(⛴)短时间）。
注意(⏲)：如(🌃)果(❌)菌液较多时可以通过几次(🎶)离心将菌体沉淀(🏆)收集到一个离(📑)心管中。
2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡(💘)液BL, 12000 rpm（-13400g）(📑)离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管(🙁)中（请使用当天处理(🛍)过的柱子）。
注意：若柱子放置较久(🤛)，需要进行这一步骤；(💈)否则，可省。
3、向留有菌体沉(👺)淀的离心管中加入500μl溶液P1（(💣)请先检查是否(🐜)已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振(📥)荡器彻底悬浮细菌细胞沉(🌾)淀，并移至2ml离心管中。如(😥)果沉淀(🕗)的菌体较多，则相应增加P1的(🎗)用量（之后(🛃)P2和P3的(🥑)用(😒)量也应成比(👑)例增加），并分到几个管子中(⛏)分别进行步骤4和5的操(🥘)作（不然P1 P2 P3的(🍭)总体积超过2ml离心管容积(👎)），步骤6过上(❕)清时(😇)可过(🤺)同一个吸附(🍠)柱(🏧)。
注意：菌体量以能够充分裂解为(🤭)佳，过多的菌体裂解(🌁)不充分会降(🌖)低质粒的提(🚗)取效率。另(🧖)外(🐝)，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的(😺)菌块会影响(⚓)裂解，导致提取(🔲)量(🏸)和(😆)纯度偏(🌓)低。
4、向离心管中加入500μ(🥛)l溶(🎵)液P2 ，温和(⛩)地上(😗)下翻转6-8 次使菌体充(🛠)分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒(🐖)受到破坏。故加(😛)入P2前(🔛)将(😜)计(🛑)时器(👆)定时4 min，以免超过时间。但是时间也(👃)不(🧝)可过短，以免裂(🍼)解不彻(🙏)底。每管操作(🏚)时间尽量(😴)一致。
注意：温和地混合不要(😵)剧烈震荡，以免(😅)污染(⛵)基因组DNA 。此时菌液应变得(💤)清亮粘稠，如果未变(🌱)得清亮，可能由(🍆)于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌(✝)体量(😔)。
5、(🌎)向离心管中加入700μl溶(🐆)液P3（记得冰上预冷），立即温(➕)和(🍉)地上下(👉)翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现(🥔)白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如(🏜)果上清量较大，需要多次过柱，可将上清(🍉)转移(👪)至新(🧑)的离心管中，以免沉淀飘起。
注意：(🕶)P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果(👓)上清(🐹)中还有微小(💯)白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、将(😂)上(🍢)一步收集的上清液分(😸)次加(📺)入吸附柱中（吸附柱(📞)放(🤛)入收集管(⛎)中，其容量为750-800μ(🛩)l）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）(🛳)离心1min，倒掉收集管中的(🤯)废液，将吸附柱放入(🔇)收集管中。
7、可选步骤：向吸(🦉)附柱中加入500ul去蛋白液(🚞)PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收(🐼)集(🥚)管(🧜)中的废(🌦)液，将吸附柱重新放(🚉)回收集管中。
注意：如果(✅)宿主菌(💇)是(🤭)end A 宿主(🏽)菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主(🥖)菌(🌠)含(📛)有大(🤩)量的核酸酶(🔀)，易降解质粒DNA，推荐采用此步(🦍)。
如果宿主菌是endA-宿(⏺)主(🐗)菌（DH5α，TOP10等），这(🐝)步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂(🐱)洗液PW（(🚻)请先(🚪)检查是否已加(😕)入无(🔒)水(🎋)乙醇），12000rpm（(✈)-13400g）离心1 min，倒掉收集(🐏)管(⚾)中的废液，将吸附(🕘)柱放入收集管中。
注意(🎦)：加入(🥉)漂洗液PW后，如(🚶)果(🎥)室温静置(⛅)2-5 min，有(🥒)助于(🏬)更好(🔰)地去除杂质(✌)。
9、重(😳)复操作步(🌱)骤8。
10、(🛥)将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）(🌂)离心2 min，目的(🕗)是将吸附柱(🧕)中残余的漂(🐥)洗液去除。
注意：(💅)漂洗液中乙醇的残留会(😾)影响后续的酶反(➰)应（酶切、PCR 等(🌛)）实验(😭)。为确保下游实验不受残留(📩)乙醇的影(⏰)响，建(🌃)议将吸附柱开盖，置于室(😋)温放置数min，以彻底晾干(🚪)吸附材料中残余的(🌷)漂洗液。
11、将(🎾)吸附柱置于一(🏬)个干(🐗)净(😌)的离心管中，向吸(🎠)附膜的中间部位(📬)悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃(🐴)预(🐀)热），室温(😳)放(😍)置或65℃水浴(🏷)2 min，12000rpm（-13400g ）(🚵)离心2min将质粒溶液收集到离(👋)心管中。
注意：为了增加质粒的(➿)回收效率，可将得到的(🏇)溶液重(🔘)新(🏃)加入离心吸附柱中．重复步(🚛)骤
11、洗(💅)脱液的pH 值(🍴)对于洗脱效率有很大影(🤲)响。若用水做洗脱(🐒)液，应保证其pH 值在(🌘)7.0-8.5 范围内（可以用(🐇)NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值(💵)低于7.0 会(🎳)降低洗脱效率(☔)。洗脱缓冲液体(🤓)积不应(🐇)少于100μl，体积(🛌)过小影响回收效(💓)率，但也不应过大，以免所提质粒浓(🚔)度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在(🍁)-20 ℃ ，以防DNA 降解。
结果判断
1、使用紫外分光光度计对质(🐏)粒浓(✅)度及纯度(🎆)进行(🈹)测定
（1）检测波长为(👊)260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μ(🐃)g/ml；(🕊)纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能(🛩)是蛋白质污染，偏高则可能是(🎌)DNA降(💾)解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会(💃)偏低，但并不(🚈)表示纯度低，因为pH值(📭)和(🥪)离(⏮)子(💵)存在会影(🏖)响光吸收(💻)值(😞)。另外，测出来的OD260和OD280都应该在(🐞)0.1-2.0之间，不然(🖌)所得出的(🕸)浓度和纯(🦄)度不准确。
（2）应该注意的是(👃)作(🎎)为空(🔈)白对(🙋)照的blank管(🕸)稀释(😋)方法应该(📔)和所测样品(👹)管一样(😺)（如样品为(🍵)2μl所(🖨)提质(👰)粒 48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液 48μ(⛩)l ddH2O）。
2、酶(🛹)切鉴(😢)定，并用(🍫)琼脂糖(🤳)凝胶电泳(🍯)检(🛤)测
（(🚴)1）选用合适的内(🏝)切酶对(🔏)所提质粒进行酶切，并与未切质粒(🔺)及转化用原质(🔧)粒(😼)一起用琼(🔐)脂糖凝胶电泳(🐍)检测(🤛)，根据酶切结果及(🛥)所提质粒与原(🚛)质粒位置(👳)是否一致(💜)，可以判定所提质粒是否为目的质粒。
（2）(📟)所提质粒（(🗯)未酶切）(🐼)的电泳条带可能为(🔺)一条带，也可能为二到三(💑)条带，这是因为质粒(😾)提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结(🛄)构的(💠)质粒(🥕)DNA单链出现(🙇)缺口（保持环状(📂)，失去超螺旋）(🧘)，或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在(🖍)琼脂糖凝胶电泳中的迁(🗄)移速率是不一样(🐒)的，因此会(🦉)出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。
测序结果的分析
构建(🧕)好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可(🕞)以(💭)直接拿去转染然后做(🎏)WB检测表(🌏)达即可。
可以正常表达的质粒(😓)我(🌬)们(👔)需要送(🦊)到测序公司测序，也可以直接送(🔸)菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即(🖐)送(🖥)菌液返还他们抽提的质粒）。
测序的引物(🥥)一般(💮)使用通用引物，如果没(🖨)有通用引物(🖨)需要自行设计。常用的通用(🚝)引物如下(✉)：
在公众号(🛶)内(⏮)回复“ 通用测(🤬)序引物 ”获取此Excel！
测序结果返回之后我们就可(🐕)以分析测(🌙)序结(📤)果了。
一般常用(🥊)的序列比对软件(🍹)有DNAMAN和Chromas，当(🐤)然，还有很多类似(🍇)软件，大家可以根(🔢)据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。
DNAMAN
1. 首先(🐲)打开(⏳)软件，左侧(👝)数字为各个(🤲)通道(🌴)的(🚣)编号，每个通道(🌓)只能载入一个序列：
2. 然后点击File->New，将我们目(⬇)的基因的(⏭)CDS序列粘贴进去，Ctrl A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测(🚍)序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全(📕)选右键载入通道2，之后(🕦)点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列(🐭)的通道，点击OK即可：
5. 后面基本是一直点击下一(⤴)步，在如下图(👤)窗口中选中Try both strands：
6. 然后(🐢)一直下一步(😟)，出来如下结果，即可比对测(🗿)序(🍴)结(🌬)果(💒)和(🏁)原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突(🐐)变，如果(🙌)是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信(📲)息，然后点击File->Blast Search:
