编辑本段次要人物
星炼
人气动漫《吸血鬼骑士》中的人物，同其他贵族阶级吸血鬼一样隶属于夜间部，担当玖兰枢的保镖，同早园琉佳一样平时沉默寡言，带有一些三无少女的色彩，对锥生零敌视吸血鬼的态度非常的恼怒（特别是用枪指向玖兰枢时），擅长武功。
夜间部：玖兰枢保镖
能力：不明 (不过擅长武功啦,很厉害)
CAST：水野理纱
星炼出场很少，每次都只露一下小脸.
夜刈十牙 CV：安元洋贵
吸血鬼猎人
零的师父，也是当年零的救命恩人
为保护零因而失去右眼睛，动画中这么说而已，漫画可没瞎
若叶沙赖 CV：植田佳奈
日间部
优姬的好友和室友
总是像大姐姐一样照顾优姬。
是个直觉很敏锐的女孩，在日间部中显得与众不同
不像日间部的其他女生那样迷恋夜间部的学生
甚至觉得夜间部的人有点可怕，对他们敬而远之。
优姬从国中开始的好朋友，同时是她在阳之寮的室友。
拥有看穿优姫烦恼的来源是零或是枢的敏锐直觉。很了解优姬，被她昵称为“小赖”。
即使知道优姬为吸血鬼后，对她的态度还是一样亲切，没有改变。
玖兰 树里（玖兰 树里（くらん じゅり，Jyuri Kuran） ）
和丈夫"悠"是亲生兄妹，玖兰一族为了保留吸血鬼纯血的血脉，兄弟姊妹通婚是相当普遍的。
优姬和枢的母亲，十年前牺牲了自己的生命而将优姬的吸血鬼因子封印了起来，利用一个血咒来把优姬所有力量及记忆封印。
玖兰 悠（玖兰 悠（くらん はるか，Haruka Kuran） ）
和妻子"树里"是亲生兄妹。
优姬和枢的父亲，为阻止李土抢夺优姬而到地面上战斗，最后被李土所持的吸血鬼猎人专门猎杀吸血鬼的剑刺中心脏而亡。
玖兰 李土（玖兰 李土（くらん りど，Rido Kuran） ）
玖兰 悠和树里的兄长，支葵千里的爸爸，跟闲订婚的人。
十年前被枢击至重伤，现在附在支葵身上，想要优姬作祭品复活，是将枢唤醒的主人，他利用树里和悠他们的孩子当作祭品唤醒枢，让他复活，其意图目前不明。 在42夜中表明了对uk的好感，因为她像树里，李士喜欢树里。43话中，被零杀死。（属于龙套角色）
白鹭更（白蕗 更（しらぶき さら，Sara Shirabuki） ）
跟枢和优姬一样是纯血种吸血鬼。
枢的朋友。
武器：
狩猎女神：
黑主优姬使用的驱魔武器，外形为可以自由伸缩的长棍，能够利用长的特点进行高跳；对除了主人以外的使用者给予电击，长棍顶端似乎有某种类似于印迹的东西，对Level E似乎有一些杀伤力，与锥生零的血蔷薇之枪的相比威力相差甚远。后期因主人玖兰优姬成为纯血种吸血鬼而接受了优姬的力量，进化成为一种型似于死神镰刀的武器，似乎威力巨大。
血蔷薇之枪：
锥生零使用的对吸血鬼武器，原主人为黑主学院的理事长——黑主灰阎；外形为长枪管式手枪，长度大约为普通手枪的一倍，子弹外形为红色十字架，特点是只能够杀死吸血鬼而不能够杀死人类（注：血蔷薇的名称来自子弹发射时的形状）。
血液淀剂：
所谓的血液淀剂就是指吸血鬼为了暂时的缓解吸血的冲动而在人类身上抽取血液，然后制成药片状可溶于水的固体；血液淀剂在以吸血鬼为题材的动漫中非常的常见，尽管血液淀剂可以缓解一时的冲动，但毕竟血液淀剂不是鲜血，味道也不像新鲜的血液那样好（很像是人类社会中的压缩饼干），而且血液淀剂的原材料大部分是从人类的身上抽取（但也有的使用人造血），被抽取血液的人类因流失过多的血液而发生贫血。
编辑本段黑主学园日、夜间部介绍
美形的精英集团 － 夜间部的学生其实全都是吸血鬼，而且是贵族以上阶级，
而这项秘密绝不能让日间部的学生知道。
所以理事长的养女优姬与零担任保守及守护著人类与吸血鬼的风纪委员
在夜日中守护和平的学园守护者……
编辑本段内容的具体说明
故事从一个寒冷的雪夜开始。 年幼的女孩优姬在漫天大雪的月夜里迷了路，意外的撞上了那传说中的噩梦代名词——吸血鬼。 生死时刻，男主角之一——玖兰枢出现了。当场将恶鬼斩杀，救下了女孩，并将她带到了黑主学园理事长那里，请求理事长的收留照顾。 十年过去了。当年的小女孩如今已是黑主学院普通班一年级的风纪委员。而当年救了优姬的久兰枢亦是黑主学院夜间部班长和社长，同时也是月之舍的舍长。 普通班在白天上课，夜间班则在夜晚上课，两个班轮流使用校舍；相互间唯一能产生交集的机会只有在傍晚两个班交换校舍的时候。 这样的安排是有其原因的。因为夜间班有一个不为人知的秘密，那就是，夜间班的所有成员，都是吸血鬼。而受人尊敬的玖兰学长，则更是被称为“吸血鬼中的吸血鬼”的纯血种吸血鬼。
吸血鬼一族都是以幽雅，秀美，才华出众的人类形态出现在世间。于是这些美艳的吸血鬼少年，就成了普通班的少女们爱慕的对象。而每天傍晚的课时交替时分，就不可避免的出现女生们拥挤在学舍前等待吸血鬼少年们的情形。 人类与吸血鬼的接触，事件本身就有着不合适的理由。于是，优姬与另一位风纪委员锥生零担负起学院守护者的职责，处理人类学生与吸血鬼接触时所出现的麻烦。
零的家人在四年前被吸血鬼所杀害，而零却奇迹般的活了下来，并受到了理事长的收留照顾，在学院里上学。不幸的往事，使得零的性格变的异常冷酷。 对于救过自己性命的玖兰学长，优姬心中存着感激与仰慕；而对于身世孤苦的零，优姬有着长姐般的关怀与身世相怜的疼惜。另一方面，玖兰虽然对优姬有好感，但似乎迟疑于某种原因，不仅仅是种族间的鸿沟；而零虽对优姬也有感觉，但迟钝的情感与坚硬的内心却阻止了他的感情。 故事就是在这样的环境中展开。
Plot
Vampire Knight primarily takes place in Kurosu/Cross Academy, a prestigious private school with an unusual class structure. The student body is divided into two classes: the Day Class, which is made up of ordinary students, and the Night Class, an elite group of 'beautiful people'. Unbeknownst to the majority of students, and even most of the staff, the Night Class is made up entirely of vampires. The heroine, Yuki, is one of the few humans who know the school's secret. She serves as a Guardian, dedicated to maintaining the peaceful coexistence of the Day and Night Classes with her childhood friend Zero, who lost his parents to vampires at an early age.
编辑本段吸血鬼等级分划表
把吸血鬼社会以金字塔来分的表格
LEVEL A 纯血种
LEVEL B 贵族阶级
LEVEL C 一般吸血鬼
LEVEL D 原本是人类的吸血鬼
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LEVEL E=LEVEL END 位于金字塔外， LEVEL D会变成LEVEL E，理性逐渐被侵蚀，一步步走向灭亡，由贵族阶级的吸血鬼统管。
编辑本段作品优点：
1.美型啊...真的是很美型啊!!!
樋野茉理老师的漫画一直都是很美型的...从最早的"とらわれの身の上"(全5卷,世代的诅咒)到"魔法王子"(全4卷,可爱系)到"WANTED"(1卷3话完!海盗的快乐冒险!就是结束的太快了啊!)
现在在LALA上的热门连载"吸血鬼骑士"...啊!!真的是吸引眼球啊!!有那么多美型的吸血鬼...
2.谜样剧情啊...
优姬谜样的身世...零身为吸血鬼猎人却成为吸血鬼的内心挣扎和对血的渴望的矛盾及其特殊的体质...纯血族的枢学长对优姬特殊的关怀和对零的憎恨...3人之间的微妙关系...奇特的理事长...文中被第一册完结章的一句“我也不知道......原来还有其它秘密”给渲染的神秘之极！
悬念解密：
优姬的身份：
现在已经揭开，优姬是玖兰家族的纯血种吸血鬼，是玖兰枢的妹妹兼未婚妻。当年，其父母为了不让她被玖兰家族的背叛者——玖兰李土抓走，牺牲自我性命，把优姬变成了普通人。所以才会有这么一个故事。优姬喝了枢的血，恢复了记忆，知道自己是一只纯血吸血鬼，也想起了枢就是自己的哥哥。
监督佐山圣子不算有名,曾在口碑不错的《精灵守护者》中担任过演出，《水星领航员》2季中担任过系列构成，担任监督的作品也不多,唯一有点名气的作品要数OVA《天使禁猎区》了。系列构成则是出任过去年备受争议的片子《萌少女的恋爱时光》，《蔷薇少女》、《素描簿》以及正在热播中的《真实之泪》系列构成的冈田磨里，另外他还负责过《水星领航员》的脚本。人设由实力原画师西田亚沙子担任，代表作有著名的百合动画《Simoun》、《桃华月惮》、《暗与帽子与书之旅人》。
编辑本段制作&声优(STAFF&CAST):
声优阵容则沿用了之前华丽到喷血广播剧阵容堀江由衣、宫野真守、岸尾大辅、福山润、千叶进步、保志总一朗、诹访部顺一等。
CAST
日间部：
黑主优姬：堀江由衣
锥生零：宫野真守
若叶沙赖：水野理纱
日间部班长：松川贵弘
新藤抚子：藤森多哉
夜间部 ：
玖兰枢：岸尾大辅
一条拓麻：千叶进步
蓝堂英：福山润
架院晓：诹访部顺一
支葵千里：保志总一朗
早园瑠佳：皆川纯子
远矢莉磨：喜多村英梨
星炼：水野理纱
红玛利亚：中原麻衣
其他人物：
黑主灰阎：乡田ほづみ
夜间部教师：松山鹰志
吸血鬼猎人协会会长：菊池正美
夜刈十牙：安元洋贵
一条麻远：石井康嗣
绯樱闲：折笠富美子
锥生零の母：浅野まゆみ
锥生一缕：宫野真守
编辑本段TV目录
01 吸血鬼之夜 night
02 血的记忆 memery
03 忏悔的獠牙 fang
04 定罪的扳机 trigger
05 月下的飨宴 sabbath
06 他们的选择 crime
07 绯色的迷宫 labyrinth
08 叹息的枪声 blast
09 红色的视线 eyes
10 黑暗中的公主 prisoner
11 愿望的代价 deal
12 纯血的誓言 pride
13 深红之锁 ring
最新消息——第二季制作决定！
由樋野茉莉的人气少女漫画《吸血鬼骑士》改编的TV版动画，可以称得上是4月最强新番之一，在本站的新番人气排行榜上，更是PK掉鲁鲁修成为人气王（2008年4月新番人气榜）。而在第一季播出的尾声，相关制作方面宣布，将在今年十月份开始推出它的第二季TV动画。另外还将从7月7日开始播出标题为《吸血鬼骑士黑主学园放送部》的在线广播，当然宫野真守、福山润、岸尾大介、诹访部顺一、千叶进步和保志总一郎等广播剧及动画版的原声优依然阵式齐全，一个也不会少。
第二季将在十月6日推出。
第二季TV目录
1 命中注定的罪人们 Guilfy
2 永远的约定 paradox
3琉璃玉的肖像 Mirage
编辑本段TV版分集介绍
01 吸血鬼之夜
故事从一个飘雪的夜晚展开，玖兰枢（纯种吸血鬼）在雪地里救下了遭到吸血鬼袭击的少女优姬，把她托付给了的黑主学院的理事长黑主灰阎，从此与这个女孩结下了不解之缘，优姬的记忆之门也从此刻开启。黑主学院与其他学院最大的不同就是分为日间部和夜间部，日间部招收的是普通的学生，而夜间部的学生都是吸血鬼，作为风纪委员的黑主优姬和锥生零，职责就是守住这个秘密不被更多的人知道，零因为家人被吸血鬼所杀对吸血鬼心存芥蒂。优姬在夜间部巡逻的时候受伤遭到吸血鬼的袭击，零赶到救了优姬，可是零发现优姬的血对自己来说也是难以抵挡的诱惑……
02 血之记忆
一年一度的圣巧克力日，女生把巧克力送给喜欢的男生并表白，日间部的女生们都异常兴奋，但是为了防止夜间部吸血鬼的身份暴露，风纪委员的担子反而更重了。圣巧克力节当日优姬和零尽力维持秩序总算没出什么问题，只是零和夜间部发生了冲突，身体也越来越不受控制。
03 忏悔的獠牙
优姬和零奉命对宿舍进行突击检查，优姬意外发现零身上藏有可疑的药品——血液锭剂，零负气离开黑主学院，优姬也跟了出去，结果在半路和零走散了，并且遭到吸血鬼的袭击，零和枢先后赶到救下了优姬。枢和黑主理事长的谈话揭开了零是吸血鬼的秘密，与此同时零失去理智咬了优姬，也暴露了其吸血鬼的身份……
04 断罪的诱因
零失去理智咬伤了优姬，黑主理事长不得不把真相告诉优姬，枢和理事长商量准备把零转入夜间部。优姬明白零对吸血鬼的憎恨，于是一个人跑到夜间部的宿舍打算请求枢撤销决定，结果差点遭到袭击。零对咬伤优姬的事深感懊悔，决定离开学院，优姬追上去抱住零，阻止了零的离开。
05 月下之餐宴
在黑主灰阎的传授下，优姬已经可以使用驯化术暂时控制零，使他不至于变成吸血鬼伤害其他人，因此零可以继续留在日间部。学院内出现的神秘老师夜刈十牙似乎和零有着某种牵连，优姬和零离开学院办事的路上遇到了异变的吸血鬼——LEVEL-E，反而被夜间部的一条所救，为了了解事情的原委，两人冒险进入了夜间部的月之寮，零无法忍受夜间部的气氛离开月之寮，优姬追赶上去发现零无法接受血液锭剂即将异变，关键时刻两人掉入水中零恢复了理志，这时自称是零师父的十牙突然出现并用枪击中了零……
06 他们的选择
十牙用施有法术的子弹射伤了零，并告诉优姬自己是零作为吸血鬼猎人时的师傅。第二天零没有来日间部上课，优姬从十牙口中得知零被隔离了，为了减轻零的痛苦，优姬自作主张找到了零，主动让零吸了自己的血。伦理课十牙和零都没有来，感到情况异常的优姬冲到零的房间，阻止十牙伤害零，十牙这才告诉她用枪射伤零是为零着想，必须克制他吸血的欲望。
07 绯红的迷宫
这一集基本是优姬、玖兰和零三个人的回忆，剧情有些零散。从优姬被理事长收养开始，然后是零的登场，夜间部的成立等等。
08 叹息的枪声
枢因为优姬的事情将自己关在房中，这时一条的爷爷突然到访……零对优姬一直保持着距离，却接到了猎人协会的任务——追捕LEVEL-E，虽然有些勉强，零还是接受了任务，优姬在暗中一路跟随，险些遭到LEVEL-E的袭击，幸好零赶到救下了优姬。
09 鲜红的视线
夜间部转来了一位神秘插班生红玛丽亚，高贵的气质不输给枢，但奇怪的个性让其他吸血鬼颇感不满。红玛丽亚的出现点燃了零的复仇之心，因为红玛丽亚和杀死零家人的纯种吸血鬼——绯樱闲似乎有着紧密的联系。
10 黑夜的公主
期末考试的前一天晚上，零找到了红玛丽亚，红玛丽亚毫不掩饰地承认自己正是杀害零父母的绯樱闲，但是零却因为身体受到控制无法打败她，目睹这一事件的优姬也被消除了记忆。突如其来的变故让零想起了多年前的往事，而失散多年的双胞胎弟弟一缕居然站在了绯樱闲的身旁。
11 愿望的代价
一缕的出现让零回忆起痛苦的过去——双胞胎兄弟幼年的往事，原来一缕心中一直充满着对家人的恨意，于是选择跟随绯樱闲，并决定向零复仇，十牙在阻止兄弟相残的过程中受伤。零和优姬参加了日间部与夜间部的联合舞会，优姬也终于下定决心接受红玛丽亚的条件，不惜一切代价拯救零。
12 纯血的誓言
绯樱闲恢复了原本的身体，为了挽救零，优姬答应让绯樱闲吸血，绯樱闲也说出了救零的方法就是喝下主人的血。零赶来阻止，不希望优姬为自己牺牲，并用理智摆脱控制打伤了绯樱闲。零和一缕正面交锋，一缕说出了憎恨零的理由，与此同时玖兰枢将绯樱闲杀死，但承诺会为她完成心愿。
13 深红之锁链
绯樱闲至死也不愿意吸一缕的血，终于伤重身亡，一缕想起和绯樱闲的回忆难过不已，零告诉一缕绯樱闲不吸他的血是为了保护他，伤心欲绝的一缕离开了黑主学院，零也即将沦为LEVEL-E。黑主理事长和十牙用锁链暂时控制住了零，但却无法救他，这时玖兰枢突然出现，对零说自己的血可以让他恢复理智，为了优姬，零喝下了玖兰枢的血液，命运的轮盘也再度开启……
获取一个基因CDS序列的方法如下：
打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）
然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）
点击CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：!
正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，
然后点击空白处Ctrl V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。
下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。
点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense
如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。
最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。
这样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。
Primer 5的使用
根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。
于是我们得到如下引物：
好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。
质粒构建
终于到正题了！
待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。
首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图：
模板的获取
PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：
现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！
连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事项及原理
注意事项：
1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。
操作步骤
1、细胞破碎
A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。
B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。
如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。
关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：
一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）
2、氯仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀
将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。
加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。
逆转录法合成cDNA
一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。
操作步骤
步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；
2. 避免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。
操作步骤
1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；
2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；
5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提取
ABOUT 质粒抽提
实验原理：
较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2 和Mg2 等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸
原理：这一步的K 置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na ，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作步骤
1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。
注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1 P2 P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。
注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。
注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。
注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A 宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
9、重复操作步骤8。
10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤
11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
结果判断
1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定
（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。
（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒 48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液 48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。
（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。
测序结果的分析
构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。
可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。
测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：
在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。
一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。
DNAMAN
1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：
2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：
5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search: